乌仁图雅、杨乌日娜、赵萨茹拉、贺喜格达来

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摘要：目的：筛选蒙药嘎日迪-13味丸抗真菌有效成分的最佳提取工艺及观察抗真菌效果。方法：以浸膏得率、抑制90%菌生长的最低药物浓度（Minimuminhibitoryconcentration,MIC90）值为指标，采用正交设计试验，综合考虑提取方法、乙醇浓度、料液比、提取次数、提取时间等4个影响因素，对抗真菌蒙药嘎日迪-13味丸提取工艺进行优选。结果：优选出的最佳提取工艺为：嘎日迪-13味丸（20目）70％乙醇溶液（10倍量），加热回流提取60min，提取一次。最佳提取工艺下，嘎日迪-13乙醇提取物对白色念珠菌MIC90值2mg/ml。结论：蒙药嘎日迪-13抑真菌效果明显且提取工艺稳定可行，为进一步研究和工艺生产提供了基础和依据。

关键词：蒙药嘎日迪-13味丸；提取工艺；正交设计试验;抗真菌

嘎日迪-13味丸(扎冲-13味丸)是蒙医常用药,由诃子、草乌、石菖蒲、木香、麝香、珊瑚、珍珠、丁香、肉豆蔻、沉香、禹粮土、磁石、甘草等13味单药组成[1],出自《至高要方》古籍。现收载于《中华人民共和国卫生部药品标准（蒙药分册）》[2]，在《中国医学百科全书》、蒙药方剂学（统编教材）[3]均有记载。主要功能是祛风通窍，舒筋活血，镇静安神，除“协日乌素”;主治半身不遂，左瘫右痪，口眼歪邪，四肢麻木，腰腿不利，言语不清，筋骨疼痛，神经麻痹，风湿，关节疼痛。实验研究表明具有抗血栓、抗真菌抗炎[4]、清除自由基[5]、脑缺血损伤保护作用[6-8]。临床研究表明嘎日迪-13治疗糖尿病周围神经病变[9]、脑埂塞[10]、腰椎间盘突出症[11]等疗效确切。截至目前嘎日迪-13抗真菌方面的仅一篇，而且此研究是针对浅表真菌感染症的治疗。偿未嘎日迪-13抗深部真菌感染相关的报道。

白色念珠菌又名白色假丝酵母菌,是一种人类和动物共患的深部条件致病性酵母菌,该菌可引起人的粘膜、皮肤、消化道、呼吸及神经系统等感染,引起白色念珠菌病(简称念珠菌病)。随着免疫抑制剂、抗生素及侵入性治疗方法的广泛应用,免疫低下患者数量逐年增加,真菌感染日渐增多,危及生命的深医院监测和研究的重点[12]。白色念珠菌是目前深部真菌感染中最常见、最主要的病原体之一,深部白色念珠菌感染的病死率高达68.90%[13]。

本试验在综合文献资料的基础上，考虑提取方法、乙醇浓度、料液比、提取次数、提取时间等多种影响因素，采用正交设计试验以浸膏得率及其抑制90%白色念珠菌生长的最低药物浓度（MIC90）值为指标，对嘎日迪-13味丸提取工艺条件进行优选。

1.材料与方法

1.1蒙成药嘎日迪-13丸（内蒙古鄂尔多斯市蒙医研究所制，批号）。

1.2菌株及培养基白色念珠球菌(candidaalbicans)（菌种编号）由中国食品药品检定研究院购买。RPMIsigmaR-10×1L、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）。

1.3主要仪器和试剂96孔细胞培养板（NUNC）、血细胞计数板、生物安全柜（BSCⅡA2-X型山东博讯）、BSP型生化培养箱（山东博讯）、旋转蒸发仪、干燥箱、中药粉碎机、二甲亚砜（DMSO）、无水乙醇、蒸馏水。

1.4有效成分提取工艺的正交试验设计

以料液比（Ａ）、提取次数（Ｂ）、提取时间／次（Ｃ）及溶媒浓度（Ｄ）为考察对象，并根据单因素实验依据，拟定各因素的３水平（表１），以提取物有效成分的得率、浸膏MIC值为综合考察指标，选用Ｌ９（３４）正交试验表进行实验，从而筛选出最佳的提取工艺条件。

按规定量称取药物９份，每份约1０ｇ，分别粉碎并编号１～９；精确称量９份药物粉末，于溶媒中加热回流提取，合并滤液并浓缩滤液至糊状，放入℃烘箱中３h，直至烘干到恒重浸膏状态，测质量并计算得率，封存备用，分别重复3次。

1.5正交试验蒙药有效成分的体外抑菌活性试验

1.5.1菌悬液的制备制备RPMI液体培养基和PDA培养基，并于４℃冰箱保存备用。取试验所用白色念珠菌菌种接种至PDA平板，28℃培养１周，活化２次，使菌落均匀覆盖PDA平板。用接种针挑取菌落于适量生理盐水，并用吸管吹打菌落，使菌游离于生理盐水中。经血细胞计数板计数。

1.5.2药液的制备精确称取各正交试验的提取物浸膏溶于10%DMSO中，配制成浸膏质量浓度为64mｇ／mＬ的溶液备用。临用前将药液用RPMI培养液按倍比稀释法稀释至工作浓度，提取物的工作浓度为32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.，0.06.0.03mg/ml。

1.5.3药敏试验方法无菌96孔平底板（Ｕ型）微量板用紫外灯照射30min后，在每一排1～10孔内分别加入药物工作浓度ul，然后再加入上述制备的真菌菌液ul，第11孔为阴性对照（只含RPMI培养液ul和药物ul，不含菌液），12孔为阳性对照（只含培养液ul和菌液ul，不含药物）。置于微量振荡板上振荡5min，使各种液体充分混匀，35℃培养48h，MIC90（最低抑菌浓度）值的判读：将药敏板每孔生长情况与阳性及阴性对照管相比较，以肉眼观察10%培养物生长的最低药物浓度孔作为观察终点，其浓度为MIC90值。

2.结果

按照正交试验设计的提取方法进行嘎日迪-13有效成分的提取，得到９份嘎日迪-13有效提取物。通过对提取得到的各浸膏得率的计算及浸膏物质对白色念珠菌MIC90值的研究分析，得出每个正交水平的有效物质得率及其对白色念珠菌MIC90值，分别计算各组试验结果的综合平均值K1、K11、K2、K21和K3、K31，极差R1、R2，结果见表2。４个因素对嘎日迪-13提取物得率的影响大小顺序为：Ｂ＞Ｄ＞Ａ＞Ｃ，以浸膏得率为指标的最优水平组合为B3D1A3C3，即30倍量50％乙醇溶液，加热回流提取３次，每次90min；４个因素对嘎日迪-13提取物MIC90的影响大小顺序为：Ｄ＞Ａ=Ｂ＞Ｃ，以MIC90为指标的结果为D3A1B1C2，即10倍量70％乙醇溶液，加热回流提取60min。

3.讨论

传统蒙药是蒙医药理论指导下所使用的明确有效药方，包括植物药、动物药和矿物质药等。蒙药方剂是成分天然，耐药性小，价格低兼等优势而受重视。也符合现在抗菌药物研究趋势，现在的药物筛选研究已从单靶标转向多靶标，从单一成分转向组合化合物。嘎日迪-13是我们在吉朱木道尔吉、嘎日迪-5、巴特尔-7、洪古日-12等蒙药"杀粘剂"中筛选出抗白色念珠菌作用最强的方剂。因此，研究和开发蒙药嘎日迪-13抗真菌对耐药菌株的产生和抗生素的短缺问题具有重要的意义。

本研究的目的不只是为了提取分离所得到的有效物质，而是从少量的传统方剂中得到更多的抑真菌效果好的有效物质，因而便以浓缩蒸干之后的浸膏得率及其MIC90值为综合评价指标，从中筛选出最优异的提取方法及条件。

本研究，单因素考察的基础上设计的正交试验。经验证嘎日迪-13最佳提取工艺下的有效物质抑菌效果明显强于一般提取工艺的有效物质，对白色念珠菌的MIC90值达到了2mg/ml的高水平。从而更完整的证实了最佳提取工艺的可行性，提高了各有效物质的产量，值得更进一步研究嘎日迪-13体内药效及有效成分进行作用机制，为合成新的抗真菌药物奠定基础。

参考文献：

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[2]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准·蒙药(分册)[M].呼和浩特:内蒙

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[3]巴根那.蒙药方剂学[M].呼和浩特:内蒙古人民出版社,.-.

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作者简介：乌仁图雅，女(蒙古族)，副主任蒙药师，博士，主要从事药品检验及蒙药新药研究工作。E-mail: